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Nuclei were stained with Hoechst 33342 (Molecular probes #C2110, 1:6000). CellTracker Blue CMAC (Molecular Probes, 1:1000 of 10 mM solution) was used as a cell volume marker. Dissociated cortical and hippocampal neurons from embryonic day 18 (E18) rat or E17 mouse embryos were prepared and transfected by calcium phosphate co-precipitation as described previously 5,71 . Neurons were plated at 70,000 cells per well in a 24-well plate coated with poly-L ornithine in Neurobasal medium (Life Technologies) and cultured at 37 °C and 5% CO 2 . The culture medium was replaced by 400 μl Opti-MEM (Life Technologies) before the DNA/ CaCl 2 mixture was added. After incubation for 45 min at 37 °C and 5% CO 2 the neurons were washed for 15 min with 1 ml opti-MEM, which had been pre-incubated at 37 °C and 10% CO 2 , and Neurobasal medium was added back to the cells. Primary cultures of dissociated hippocampal neurons were fixed at 3 days in vitro (d.i.v.) with 4% paraformaldehyde/15% sucrose in phosphate buffered saline (PBS) for 20 min, permeabilized with 0.01% Triton X-100/0.1% Na-Citrate/PBS for 10 min on ice and stained with primary and secondary antibodies in 10% NGS/PBS. A Zeiss LSM 700 or LSM 800 confocal laser scanning microscope was used for imaging. Image analysis was done using ImageJ 1.45 s (NIH), and Adobe Photoshop CS5.

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