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    We then designed three derivatives of Lys01 that would serve as a preliminary test of the significance of dimerization, the C-7 chlorine, and the linker length for activity. Initial studies demonstrated that all three factors, dimerization, C-7 chlorine, and the linker length contribute to the enhanced activity in autophagy and cytotoxicity assays observed with Lys01. Lys01 treatment of LN229 and LN229 GFP-LC3 glioma cells produce a 10-fold more potent blockade of autophagy compared with CQ or HCQ as evidenced by LC3-II/LC3-I ratio on immunoblotting and the accumulation of large confluent GFP-LC3 puncta using fluorescence microscopy. Electron microscopy confirmed a massive difference in both size and number of autophagic vesicles that accumulate in cells treated with 10 µM Lys01 compared with 10 µM HCQ. A bafilomycin A 1 clamp experiment confirmed Lys01 is an autophagy inhibitor and not an autophagy inducer. The functional consequence of this more potent autophagy inhibition is that Lys01 treatment produces a 3- to 10-fold lower IC 50 in multiple human cancer cell lines using the 72 h MTT assay compared with CQ or other Lys01 derivatives tested, with more significant differences between Lys01- and HCQ-associated IC 50 s being observed in cell lines that are highly resistant to HCQ. To conduct in vivo studies we synthesized the water soluble salt of Lys01, Lys05. In two melanoma xenograft models and a colon cancer xenograft model, intermittent high dose Lys05 or chronic daily dosing of Lys05 at lower doses produces significant early blockade of autophagy in vivo, and has single-agent antitumor activity at doses as low as 10 mg/kg i.p. daily. In contrast, single-agent high dose HCQ treatment administered intermittently does not produce clear evidence of autophagy inhibition at early time points, and is associated with tumor growth compared with control in one model.

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